乳酸菌真空冷冻干燥简称冻干，是指将乳酸菌细胞悬液置于冰点以下的温度进行预冻，利用真空环境下冰晶低温升华去除水分，进而以冻干粉形式保存的技术。冻干可使菌体保持原有生化特性及活性。但冻干过程也会造成乳酸菌的活性降低，甚至死亡。
为进一步提高冻干后乳酸菌存活率及延长贮藏期，宁夏大学葡萄酒与园艺学院的刘开文、马雯、金刚*就冻干过程中影响乳酸菌存活率的因素及提高其存活率、延长贮藏时间的措施进行总结，旨在为制备活性高且耐贮藏乳酸菌制剂提供相关依据与参考。
真空冷冻干燥分为冷冻和干燥两个阶段，均会导致乳酸菌活力下降甚至死亡。冻干过程主要是通过以下方面影响乳酸菌的存活率。
在冻干过程中温度的急剧下降导致细胞内水分结晶，损伤细胞膜，进而对乳酸菌菌体产生物理损伤。众多研究表明，冷却速率会极大地影响冰晶的产生，冷却速率过快，易产生较大的冰晶，从而刺破细胞，导致细胞损伤。在冻干过程中，存在两个最大的冰晶生成温度带，即0～－3.7 ℃和－30～－37.4 ℃。在上述温度区间内，若物料温度升降缓慢，会产生较多冰晶，更易损伤菌体。因此，快速通过最大冰晶生成带可以有实际效果的减少菌数损失。
细胞膜能隔绝外界环境，是乳酸菌的重要保护屏障，其完整性是冻干成功的关键。在干燥脱水环节，磷脂双分子层头部基团上的水分子被酰基替换，致使链间的作用力增大，同时磷脂分子的状态也从液晶态向凝胶态转化，使磷脂分子之间产生空隙，细胞膜的通透性增大，引起细胞内物质的泄露，以此来降低细胞的活力（图1）。
膜的流动性与磷脂分子脂肪酸饱和度及长度紧密关联。增加不饱和脂肪酸的比例能大大的提升细胞膜对不良环境的抵抗力。乳酸菌菌体可通过增加胆固醇在细胞膜中的比例、调节饱和/不饱和脂肪酸的比例从而调节外界环境对其造成的影响。
由于细胞内外液组成成分不同，故凝固点也不同，即冻干过程中，菌体内外液的冻结时间不同步。胞外液凝固点较内液高，在冷冻过程中更早被冻结、浓缩，为维持细胞内外渗透压平衡，细胞内液向外移动，致使内液溶质浓缩，此现象又称“溶质效应”。“溶质效应”可使细胞物质代谢紊乱或蛋白失活，甚至造成细胞死亡。
细胞内酶的活力与菌体的物质交换、能量代谢以及生长速度等紧密关联，而冻干会因为脱水引起细胞内酶类及蛋白质失活；细胞失水会破坏蛋白质与水分子、细胞膜之间的相互作用力，从而削弱蛋白质的高级结构，降低酶的活性，进而影响蛋白质的构象，使其失去功能。故在冻干后细胞中保持一定的水分很关键。
遗传稳定性改变是导致细胞失去活性的根本原因之一。干燥引起的DNA结构变化是导致细胞生理损伤的根本原因。乳酸菌的遗传物质为DNA双螺旋，常与载体蛋白形成复合体存在。冻干过程中脱水会导致载体蛋白变性，使DNA双螺旋结构稳定性降低。此外，由于失水量的增加，会导致细胞溶质浓度升高，电荷发生改变，削弱DNA中碱基对之间的疏水性，使菌体的双螺旋结构稳定性降低，进而影响其转录、翻译和复制，甚至发生基因变异。
乳酸菌的体外培养与培养基紧密关联，培养基是适合微生物生长所需的碳源、微量元素、氮源、水分等各类营养的东西组成的混合物。通过对MRS培养基中各组分的比例来优化，能够对乳酸菌代谢关键酶（β-半乳糖苷酶、K ＋ -ATP酶等）起到保护作用，来提升乳酸菌的生理活性。此外，由于乳酸菌的菌株特异性和多样性，不同种 类的乳酸菌对培养基中各种成分的偏爱程度不同，因此，可以根据不同乳酸菌的特异性，开发出特异性优化培养基，从而增强菌体的生理活性，进而提高菌体的冻干存活率。
生物膜是乳酸菌的重要保护屏障，同时也是维持细胞内外物质交换的场所，并具有一定的机械稳定性。研究表明，细胞膜的形成与培养基中的碳源密切相关，如培养基中缺乏碳源，可使细胞膜形成困难，反之，碳源浓度过高又会抑制细胞膜形成，故合适的碳源浓度有助于菌体细胞膜合成。 故合适的碳源浓度 有助于菌体细胞膜合成。 另外 Mn 2＋ 、 Mg 2＋ 和 Fe 3＋ 等一些 金属离子也对细胞膜的形成有影响。 但并非所有的金属离子都对细胞膜形成有积极作 用，如 Cu 2＋ 、 Al 3＋ 、 Zn 2＋ 和 Pb ＋ 等金属离子可抑制生物膜 形成，不利于菌体抵抗逆境 。 因此，在培养基中选择 性地添加一些金属离子，如 K ＋ 、 Ca 2＋ 等能够促进细胞膜 的形成，增强菌体抗逆性，进而提高冻干存活率。
冻干过程中细胞会因为脱水导致细胞膜流动性降低，代谢功能受阻，菌株冻干存活率降低。脂肪酸对细胞膜的流动性起着至关重要的作用，其中较高的不饱和脂肪酸含量可提高细胞膜的流动性，从而增强细胞对逆境的抗性。为此，研究者们采用了多种方法，如通过调节培养基pH值、加入适当浓度的油酸、无机盐离子、吐温-80等组分可使不饱和脂肪酸含量增加。
总之，通过对培养基组分的优化，能够增强乳酸菌生理活性，提升乳酸菌自我保护能力，增加乳酸菌细胞膜不饱和脂肪酸含量，增强乳酸菌细胞膜的流动性，显著提升其冻干存活率。
胁迫预处理是指将乳酸菌菌液放置特定环境中一段时间，锻炼菌体在该环境下的耐受性，增强其对逆境的抵抗能力，从而提升菌株的冻干存活率。一般的胁迫预处理方式有冷胁迫、酸胁迫和热胁迫等。
冷胁迫预处理可以显著增强菌株对低温的耐受性，其作用机理可能与维持细胞膜的流动性及促进冷应激蛋白的表达有关。在此过程中，低温可以使乳酸菌细胞膜上的脂肪酸成分发生变化，进而增强其对低温的耐受性。研究发现，随着不饱和脂肪酸含量的增加，细胞膜的流动性相应增强，抗冻性能也随之增强。此外，冷胁迫还可以促进细胞内冷应激蛋白（cCSPs）的表达，增强细胞对冷冻的耐受能力。同时，CSPs还能防止细胞由于相关酶的变性失活引起的菌体损伤，提高了细胞的低温耐受性。因此，针对不同的乳酸菌进行不同的预冷胁迫处理可以提高其冻干存活率。
热胁迫是将乳酸菌置于比其生长适宜温度更高的条件下，使其进行一段时间的高温胁迫，提高乳酸菌的逆境耐受性。研究发现，热胁迫预处理的微生物有较高的冻干存活率，且经过处理的微生物在真空冷冻干燥后能快速恢复生长和产酸。此外，菌体的糖代谢和能量代谢能力也得到了提高，与对照组相比，多糖含量增加了32.24%，半乳糖产量增加9%。 综上，热胁迫处理促 进了菌体的热激蛋白的表达，对维持细胞的能量代谢， 维持 细胞的生存有积极作用，从而提高细胞的抗冻性和 存活率。
酸胁迫预处理是指将乳酸菌放置于其适宜酸性环境下一段时间，以提高菌体的冻干存活率，不一样的种类的乳酸菌有各自专属的酸胁迫预处理条件。酸胁迫预处理主要通过调节菌体细胞的糖酵解途径和脂肪酸代谢途径以增强抗冻能力。有研究之后发现，酸胁迫促进了菌株糖酵解途径中丙酮酸与乳酸之间的相互转化，为菌体细胞提供更多生长所需的能量，菌体细胞通过利用这些能量增强对逆境的耐受性。 经过酸胁迫预处理 的乳酸菌，其在冻干过程中细胞膜的完整性和流动性均 得到改善，冻干存活率也明显提高。
除单一胁迫外，国内外学者还开展了多因素协同胁 迫的研究。 交互胁迫预处理需要在 不同的胁迫条件下进行，故对各种胁迫条件的要求很严 格，因此有待于进一步的研究。
国内外学者多年的研究发现，有很多因素会对乳酸菌冻干存活率产生影响，包括细胞生理状态、细胞大小、菌液浓度、pH值以及冷冻保 护剂等，其中保护剂对菌体的保护效果较为突出。保护剂可以增强菌体冻干过程中各生理机能的稳定性，优良的冻干保护剂可以改善菌体冻干时的环境，能较好地缓解菌体在冷冻干燥过程中受到的各种损伤。最大限度地保留菌体原有的各种生理生化特性和生物活性。
冻干保护剂分类的方法有很多，按其渗透性可以分为3 类，即渗透性保护剂、半渗透性保护剂及非渗透性保护剂。如图2所示，渗透性保护剂指可以很容易的透过细胞膜进入细胞内部发挥作用的物质，如甘油就是一种典型的渗透性保护剂，它能大大的提升细胞膜的流动性，从而抑制细胞内冰晶的形成，进而实现对菌体的保护；半渗透性保护剂指能穿过细胞壁而不能穿过细胞膜发挥作用的物质，其能诱导菌体质壁分离，抑制冰晶的形成，包括单糖、蔗糖、氨基酸等；非渗透性保护剂指被排除在细胞外部，在细胞外侧为菌体提供保护的物质，包括多糖、海藻糖、脱脂乳等大分子，这类保护剂通过在细胞壁外侧形成保护层实现对菌体的保护，从而减轻细胞的损伤。
按冻干保护剂的化学结构可以分为有机保护剂和无机保护剂，如表1所示，由于有机保护剂所特有的结构与乳酸菌的有效抗冷冻密不可分，而无机保护剂仅表现为无机盐，故在乳酸菌发酵剂生产过程中广泛应用有机保护剂提升冻干存活率。
不同的组织、细胞对冷冻处理有不同的响应。由于不同保护剂的作用机理存在很大差别，并且在多数情况下，单一的保护剂只能发挥单一的效果，不能为组织、细胞提供最佳的保护效果。因此，复配多种保护剂以达到最佳保护效果是重要的优化途径。
国内外研究表明，通过正交试验和响应面法，将不同种保护剂以一定比例进行复配对菌体的保护效果更好，显著提高了活菌数和发酵活力。不同的保护剂配方对冻干乳酸菌的存活率有很大的影响。
但截至目前，由于菌种的特异性以及不同保护剂的保护机理不同，仍没有发现一种有效适合所有乳酸菌的冻干保护剂配方。 如表2所示，为了最大限度地提高乳酸菌真空冷冻干燥的存活率，研 究者们针对不同种类的乳酸菌筛选出了不同的保护剂组合。 其中，5%蔗糖、2%甘油、0.8%谷氨酸钠、1%抗坏血酸、5%海藻糖为嗜热链球菌MN002的最优保护剂配方； 而10%脱脂乳、7%海藻糖、2%山梨醇和0.6%酪氨酸为复合冻干保护剂时，冷冻干燥植物乳杆菌L2的存活率高达92%。 双歧乳杆菌的最佳保护条件为甘氨酸5.5%、碳酸氢钠0.8%、低聚木糖7%、精氨酸4.5%、脱脂乳25%时，可使其冻干存活率达到90.37%。 因此，对于不同的种类要筛选不同的保护剂配方。
为获得更高的菌体存活率，需要严格控制真空冷冻干燥工艺。目前有研究表明菌体在冻干过程中的活性损失大部分发生在预冻阶段。预冻处理是将物料中的游离水冻结，为之后的干燥处理做准备，预冻处理主要影响菌体产生的冰晶大小。故合适的预冻温度和冷却速率也是真空冷冻干燥工艺的重要环节。若冷却速率过快，会产生大的冰晶，同时延长细胞的脱水过程，会对菌体造成极大的伤害，但快速冷却可以避免溶质效应和细胞过度收缩。同时冻干厚度、菌泥与保护剂的比例也对冷冻干燥质量产生影响。
如果冷冻温度不够，则会使菌液冻结得不够彻底，造成菌液在升华干燥时发生膨胀、起泡现象，从而影响菌粉的品质；但若预冻温度太低，不但会造成菌液的浪费，而且还会加剧对菌体的伤害，影响其冻干存活率。因此，合适的预冻温度对乳酸菌的冻干至关重要。不同类型的乳酸菌，其最适预冷冻温度差别很大。如表3所示，针对不同种类的乳酸菌，研究人员筛选了不同的预冷冻温度，同属的乳酸菌处在不同条件下，最佳的预冷冻温度也会有所差 异。Wang Guangqiang等的研究表明，当使用山梨醇作为保护剂时，植物乳杆菌AR113、AR307、WCFS1的最佳预冷冻温度分别为－196、－40 ℃和－20 ℃，而当使用海藻糖为保护剂时，它们三者的最佳预冷冻温度为－20、－60 ℃和－60 ℃。因 此，最佳预冻温度的选择是乳酸菌冻干过程中的重要环节。
在预冻过程中，冷却速率是乳酸菌活力的关键因素。如图3所示，在预冷冻阶段，合适的冷却速率可以减轻细胞在冻干过程中受到的损伤。a表示冷却速率过慢，细胞由于过度脱水收缩，容易发生“溶质损伤”，过度收缩，可导致蛋白失去活性，从而使细胞失去活性而死亡；c表示冷却速率过快，易导致胞内和胞外的水分子结成冰晶，进而穿透细胞，给菌体带来严重的物理伤害；b表示最适的冷却速率，在此条件下，细胞不会出现过度脱水收缩和胞内结冰，能够最大程度降低细胞受到的损伤。不同种的乳酸菌有其不同的最适冷却速率，在冷却速率为－1 ℃/min时植物乳杆菌ST-3的冻干存活率最高，而在－10 ℃/min条件下，干酪乳杆菌LC2W可以得到最高的冻干存活率。 目前，冷却速率在乳酸菌真空冷冻干燥过程中对其冻干存活率影响的研究比较匮乏， 因此，研究乳酸菌的最适冷却速率至关重要。
冻干保护剂与菌泥的配比也会影响乳酸菌的冻干活性。保护剂浓度过低，不能充分保护乳酸菌在真空冷冻干燥过程中的活性；保护剂浓度过高，细胞冻干存活率也会下降，究其原因可能是保护剂浓度过高时阻碍了水分的挥发，导致冰晶的生成，从而提升了细胞的死亡率。如许女等的研究表明，以甘油0.5%、山梨醇2%、麦芽糊精1%、脱脂奶粉10%、海藻糖1.5%为冻干保护剂配方，保护剂与菌泥的混和比例为1∶3时，植物乳杆菌MA2的冻干存活率为61%。因此，选择合适的混合比例非常重要。
在冻干过程中，冻干厚度也是一个重要的环节。冻干厚度会对后续冻干时间以及最后冻干产品的性状产生影响，研究表明，如果样品太薄，不仅极易融化，而且在真空冷冻干燥后，样品的冻干存活率较低，复水率也相对较低；反之，增加样品厚度则不易融化，降低了对菌体的伤害；但是，过厚的样本，会延长冻干所需的时间。张雅硕等研究之后发现，0.5 cm是副干酪乳杆菌的最佳冻干厚度。植物乳杆菌299的最佳冻干厚度为1.2 cm。因此，选择最优的冻干厚度有利于乳酸菌的冻干保护。
贮藏温度对保持益生菌的活性至关重要，过高的温度会导致氧化反应或膜脂质相转变，这对益生菌的存活不利；而低温环境保存能使冻干菌体的活力得到很好的保护。因此，冻干粉最好保存在低温度的环境中，并且在使用时一定要进行低温诱导，以免引起过敏现象。
众多研究表明冻干粉贮藏环境中的气体组成、含氧量等对冻干菌体的保存性能有很大的影响。 因此，在低氧环境下贮藏冻干粉，可有效地增加微生物数量，并保持其良好的活性。
含水量对乳酸菌贮藏期间的存活具有非常明显影响。乳酸菌的酶活性、物理反应速率等都对水分活度有所依赖。因此，只有保持较低且稳定的含水量和水分活度，才可能正真的保证乳酸菌冻干粉的贮藏稳定性。
包装指使用一种或多种封装材料，在微生物与周围环境之间形成物理屏障，从而保护微生物。一般冻干菌粉的贮藏时间受阳光、湿度、氧气、pH值、渗透变化等因素的影响，为保存冻干产品常采用阻氧、阻光的包装材料以排除这一些因素的影响。此外，还需考虑冻干产品和包装材料之间的交互作用。
目前，真空冷冻干燥制品的包装材料使用最多的是玻璃、塑料、橡胶和一些金属材料，但玻璃具有易碎性、质量大等缺点；塑料的阻氧性等客观因素使其推广受限。因此，将不一样的材料复合应用可以弥补缺陷，多层复合薄膜外层是可印刷的双向拉伸聚丙烯薄膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯，内部是封热性能高的流延聚丙烯薄膜、聚乙烯材料等，中间还可采用铝箔、乙烯-乙烯醇共聚物等材料提高阻隔能力。
近年来，真空冷冻干燥技术已成为医药、食品制造业中的一种很重要的技术。利用真空冷冻干燥技术生产出高活菌数且能长期保持活性的乳酸菌菌粉是医药及食品发酵工业的重要研究目标。本文分析了乳酸菌细胞在真空冷冻干燥过程中的损伤及保护机理，并在此基础上对其生长培养基、胁迫预处理、冻干保护剂、工艺条件、封装材料等方面对乳酸菌冻干存活率和贮藏时间的影响因素进行了总结，对乳酸菌发酵剂的冻干保藏技术在保护性条件选择方面有一定的参考作用。保护性条件不仅仅可以提高乳酸菌在冻干过程中的存活率，同时也对贮藏过程中乳酸菌的活力与稳定性有一定积极的影响。目前研究者们在提高乳酸菌生物膜合成与抗冻性、筛选最佳保护剂组合、贮藏保护性条件等方面开展了大量研究，但仍有不足。首先，有关具有普适性保护效果冻干保护剂的配方研究较少；其次，研究表明，乳酸菌冻干粉在低温、避光及真空环境下能基本实现长期贮藏，开发新型复合封装材料能更好地维持其贮藏稳定性；最后，应加强促进开发乳酸菌生长发育的新型益生元类保护剂，减少在冻干过程中营养元素的损失，进而提高乳酸菌冻干存活率、延长贮藏期。
本文《真空冷冻干燥提高乳酸菌存活率及延长贮藏期的研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷2期325-333页. 作者：刘开文, 马雯, 金刚. DOI:10.7506/spkx0801-002. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为进一步促进未来食品科学的发展，全面践行“大食物观”的指导思想，持续提升食品科学技术创新和战略安全。由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，北京工商大学食品与健康学院、北京联合大学生物化学工程学院、西华大学食品与生物工程学院、大连民族大学生命科学学院、齐齐哈尔大学食品与生物工程学院、河北科技大学食品与生物学院共同主办， 登赫（上海）生命科学有限公司、北京盈盛恒泰科技有限责任公司、古井集团、嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司、北京三元食品股份有限公司赞助 的“第一届大食物观·未来食品科学技术创新国际研讨会”即将于 2024年5月16-17日 在 中国 北京 召开。
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